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上海百奥几何生物科技有限公司建设项目

审批

上海-上海-浦东新区

发布时间： 2025年06月13日

项目详情

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1、建设项目基本信息

企业基本信息

建设单位名称：建设单位代码类型：建设单位机构代码：建设单位法人：建设单位联系人：建设单位所在行政区划：建设单位详细地址：

****
****0115MADXL95NX0	唐建
李婷婷	市区
市区新场镇古恩路154、156、158号5幢1层

建设项目基本信息

项目名称：项目代码：项目类型：建设性质：行业类别（分类管理名录）：行业类别（国民经济代码）：工程性质：建设地点：中心坐标： ****机关：环评文件类型：环评批复时间：环评审批文号：本工程排污许可证编号：排污许可批准时间：项目实际总投资(万元)：项目实际环保投资(万元)：运营单位名称：运营单位组织机构代码：验收监测(调查)报告编制机构名称：验收监测(调查)报告编制机构代码：验收监测单位：验收监测单位组织机构代码：竣工时间：调试起始时间：调试结束时间：验收报告公开起始时间：验收报告公开结束时间：验收报告公开形式：验收报告公开载体：

****建设项目

2021版本:45--098-专业实验室、****基地	M73-M73-研究和试验发展
	市区新场镇古恩路154、156、158号5幢1层
经度:121.64492 纬度: 31.07965	****环境局
	2024-11-21
沪浦环保许评〔2024〕282号	****
2025-03-13	500
40	****
****	****
****	******公司
****0112MA1GC88YXW	2025-01-20
2025-02-10	2025-04-30
2025-05-19	2025-06-13
	https://e2.**.cn:8081/jsp/view/jsxmInfo_edit.jsp?id=0C19F0E1C**501B76E60B7D62DAE4D

2、工程变动信息

项目性质

环评文件及批复要求：实际建设情况：变动情况及原因：是否属于重大变动：是否重新报批环境影响报告书(表)文件：

**	**
无变动

规模

环评文件及批复要求：实际建设情况：变动情况及原因：是否属于重大变动：是否重新报批环境影响报告书(表)文件：

生物酶在医药中间体合成中的应用及研发实验规模约600批次/年、生物酶在抗体药合成中的应用及研发实验规模约200批次/年	生物酶在医药中间体合成中的应用及研发实验规模约600批次/年、生物酶在抗体药合成中的应用及研发实验规模约200批次/年
无变动

生产工艺

环评文件及批复要求：实际建设情况：变动情况及原因：是否属于重大变动：是否重新报批环境影响报告书(表)文件：

本项目主要从事化学药和生物药的小试研发实验，主要包括生物酶在医药中间体合成中的应用及研发实验，以及生物酶在抗体药合成中的应用及研发实验，研发实验内容均类似，研发实验总体工艺流程如下图所示：图2-2 生物酶在医药中间体/抗体药合成中的应用工艺流程图具体工艺流程及说明如下： 1、酶挖掘图2-3 酶挖掘工艺流程图工艺流程说明：从文献或者AI预测找出相关酶的基因序列并进行筛选，以此作为基因探针在公共基因组数据库中检索，筛选得到与探针序列具有一定同源性的基因序列，**公司进行合成，将委外合成的表达载体为pET 28a的基因序列取回。 2、酶表达和发酵 (1)质粒构建：图2-4 质粒构建工艺流程图工艺流程说明：实验室内使用电转仪等设备将表达载体为pET 28a的基因序列转入宿主细胞，即大肠杆菌BL21(DE3)/大肠杆菌DH5α/大肠杆菌TOP10内，重组质粒进入宿主细胞后，融合到宿主细胞的染色体中，随后遵循细胞的转录和翻译机制，将细胞加入LB培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等），置于37℃恒温摇床内培养30~60min，使用离心机以3000rpm的转速离心2min，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂平板，再把平板放入37℃培养箱培养过夜。以上过程产生的离实验室废液S1，产生的废培养基及一次实验室固废S2。 (2)质粒提取：图2-5 质粒提取工艺流程图工艺流程说明：使用AxyGen公司的Plasmid Miniprep Kit试剂盒用离心法提取，具体如下： a.质粒提取将前文培养超过8h的菌液置于2mL试剂盒配套的EP管中，使用离心机以12000rpm的转速离心1min，弃尽上清。用250μL已加入试剂盒配套的RNase A（核糖核酸酶A）的Buffer S1细菌悬浮液（S1核酸酶）悬浮EP管底部的菌体，人工使用移液器的枪头吹打使菌体悬浮均匀。加250μL试剂盒配套的Buffer S2细菌裂解液，温和并充分的手动上下翻转4-6次混合均匀，直至形成透亮的溶液。加入350μL试剂盒配套的Buffer S3中和液，温和并且充分的手动上下翻转6-8次混合均匀，使用离心机以12000rpm的转速离心10min。将EP管中离心后的上清液倒入试剂盒内配有的DNA制备管（置于2mL离心管中）中，使用离心机以12000rpm的转速离心1min，弃掉滤液。将DNA制备管置回2mL离心管内，加500μL试剂盒配套的Buffer W1洗涤液，使用离心机以12000rpm的转速离心1min，弃掉滤液。将DNA制备管置回2mL离心管内，加700μL试剂盒配套的 Buffer W2去盐液，使用离心机以12000rpm的转速离心1min，弃掉滤液；以同样的方法再加700μL试剂盒配套的Buffer W2去盐液再洗涤一次。洗涤后弃掉滤液。将制备管置回2mL离心管中，使用离心机以12000rpm的转速离心1min。将制备管置回1.5mL离心管中，在DNA制备管膜中央加 20-40μL超纯水（超纯水预先水浴加热至65℃), 在室温下静置1min，使用离心机以12000rpm的转速离心1min。丢掉DNA制备管，离心管底部的液体即为质粒。 b.琼脂糖凝胶电泳提前使用超纯水将制胶工具清洗干净，准备好制胶平板，用琼脂将模具边缘封闭，架好梳子；根据要分离的样品（DNA）大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶。使用纯化水将琼脂糖加热融化，再将融化后的琼脂溶液摇晃混匀，倒入电泳槽中，在室温下等其凝固30-40min后，小心的拔出梳子，取出凝固好的凝胶放入电泳槽内，准备上样。在电泳槽中倒入电泳TAE缓冲液，倒入没过胶面1mm左右，去除胶孔内的气泡。上样，取1-2μL的 DNA样品加入电泳上样缓冲液，用枪混匀后加入到凝胶孔内。上样结束后，接通电源，红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极向正极运动，加样孔侧为负，在120V电压下跑12min。结束后关闭电源，在凝胶成像系统上观察观察是否有符合质粒大小的明亮条带。 c.将装有质粒(pET 28a-KRED)的离心管标记好，置于-20℃冰箱内保存冷藏，作为PCR模板或者质粒转化时使用。以上过程离心上清液、实验室废液S1，离心管、枪头等一次性耗实验室固废S2。 (3)质粒转化：图2-6 质粒转化工艺流程图工艺流程说明：将提取好的质粒加入100uL感受态细胞（大肠杆菌BL21(DE3)/大肠杆菌DH5α/大肠杆菌TOP10）中，在低温循环水浴器内冰浴30min，再于42℃水浴中热激90s，之后迅速放置冰上冷却5min，再加入1mL的LB培养基（主要成分为蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等），置于37℃恒温摇床内复苏1h，将复苏的培养物使用离心机以3000rpm的转速离心100min，取出其中1mL的上清液，将其余的培养液涂布于含抗生素抗性（卡那霉素）的LB平板培养基上，将培养基放置于37℃恒温培养箱或37℃恒温摇床内培养过夜。人工使用移液器挑取单菌落后，重复上步骤“(2)质粒提取”工艺，再将提取公司进行测序验证，验证pET 28a质粒是否转移到细胞内，验证后得到BL21/pet28a-KRED菌体。以上过程会实验室废液S1，离心管、枪头等一次性耗材及实验室固废S2。 (4)酶表达：图2-7 酶表达工艺流程图工艺流程说明：将BL21/pet28a-KRED菌体加入含有抗生素（卡那霉素）的LB培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等，下同）中，放置于37℃恒温摇床内振荡培养至用分光光度计测得OD值=0.6-0.8后，加入0.2mM的IPTG诱导液，于30℃恒温摇床内振荡培养过夜。使用离心机以8000rpm的转速将培养液离心5min后收集细胞，用0.05M、pH7.0的磷酸盐缓冲液（企业自制，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等，下同）重悬细胞，再使用高压均质机或细胞破碎仪破碎细胞。使用离心机以12000rpm转速4℃离心20min后收集上清，再使用冷冻干燥机将上清液在低温下快速冻结，然后在适当的真空环境下，使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出，使物品干燥，制备成冻干酶粉；冷冻干燥机将升华出的水蒸气通过冷凝器冷凝成凝结水排出，识别为冷凝废水W1。以上过程产生的离实验室废液S1，离心管、枪头等一次性耗实验室固废S2。 (5)酶发酵：图2- 8 酶发酵工艺流程图工艺流程说明： a.将构建的基因工程菌BL21/pet28a-KRED接入LB斜面培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母粉、氯化钠、甘油或葡萄糖、琼脂糖）中，在37℃恒温培养箱内培养18h； b.接1环斜面基因工程菌BL21/pet28a-KRED菌种于LB液体种子培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母粉、氯化钠、甘油或葡萄糖）中，在37℃恒温培养箱内培养8h； c.在2L发酵罐中装入重新配置的液体种子培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母粉、氯化钠、甘油或葡萄糖），再将前文制得的LB液体种子培养基以7％体积比种量接入液体种子培养基内，放入2L发酵罐中，保持初始转速200r/min、初始通空气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在25％以上，期间使用20％氨水调节pH值稳定在7.0，在37℃条件下培养9h，再降温至26℃表达。发酵过程定期打开排气阀，利用气体管路进行排气，该过程会产生发酵废气G1（主要成分为氨、臭气浓度）。发酵过程中采用pH-stat方式流加补料培养基（补加LB培养基浓缩液，成分种类不变，仅增加蛋白胨含量）。发酵结束后，使用冷冻离心机以8000r/min的转速在4℃下离心10min收集菌体，再使用无菌生理盐水（企业自制，主要成分为氯化钠）洗涤基因工程菌2次。将发酵液使用冷冻离心机以8000rpm转速离心5min收集细胞，使用0.05M 、pH7.0的磷酸盐缓冲液（企业自制，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等）重悬细胞，再使用高压均质机或细胞破碎仪破碎细胞。使用冷冻离心机以12000rpm转速在4℃下离心20min后收集上清，再使用冷冻干燥机将上清液进行冷冻干燥，制备成冻干酶粉。实验室废液S1、实验室固废S2、冷凝废水W1。 3、生物催化反应图 2-9 生物催化反应工艺流程图工艺流程说明： (1)生物催化反应：本项目化学药研发实验选取具有代表性的“医药中间体4-氯乙酰乙酸乙酯”作为示例，在2L反应釜内投加180g/L原料溶液，即医药中间体（如：4-氯乙酰乙酸乙酯），加入NADH辅酶、异丙醇，使用氢氧化钠调节pH为7.0，然后再加入步骤(5)“酶发酵”制备的冻干酶粉进行合成转化反应，转化过程中使用全自动电位滴定仪自动加柠檬酸/33%盐酸/98%硫酸/85%磷酸控制pH在7.0，使用低温循环水浴控制温度在40℃,同时使用配套搅拌器磁力搅拌控制转速500rpm，随时观察产物转化情况，直到检测不出原料后结束反应。通过比较反应结束时间、反应釜内产生生成情况判断酶的催化活性，从而得出酶催化性能的结论。该过程反应方程式如下所示：本项目生物药研发实验选取具有代表性的“抗体”作为示例，抗体在 SrtA（半胱氨酸转肽酶）和抗payload抗体存在下，使用低温循环水浴控制温度在30℃,使用搅拌器磁力搅拌控制转速450rpm下搅拌10h，合成被抗payload抗体修饰的抗体，主要原理为酶分子与抗体或抗体分子共价结合，该过程反应方程式如下所示：此过程在通风橱内进行操作，反应过程中实验容器保持封闭状态，仅在反应容器开关盖过程反应物中挥发废气逸散，会产生反应废气G2；反应后反应容器中剩余化实验室废液S1处置。 (2)提纯、分析测试：反应结束后，在部分反应物中人工加入二氯甲烷、三氯甲烷作为萃取剂进行萃取，目的是利用液态的萃取剂处理与之不互溶的双组分或多组分溶液，实现组分分离；萃取后将提纯后的溶液转移到旋蒸仪中进行旋蒸，抽走二氯甲烷、三氯甲烷，得到提纯后的产物；该过程二氯甲烷、三氯甲烷试剂挥发会产生有机废气，并入试剂挥发废气G3中一并识别。提纯后使用高通量气相色谱仪、高通量超高压液相色谱仪、高通量超临界二氧化碳色谱仪(UPCC)等设备对提纯后的样品进行分析测试，得出结论。该过程会使用乙腈、甲醇等有机溶剂，会产生试剂挥发废气G3、实验室废液S1、实验室固废S2。经分析实验室废液S1，作为危废处置。 4、酶定向进化图2-10 酶定向进化工艺流程图工艺流程说明：根据前文分析测试结果对酶进行优化。此工序利用定点突变试剂盒完成，利用PCR扩增技术进行体外基因定点突变。主要工序如下： (1)首先，需要先使用电脑设计用于突变的引物D320F、D320R，在引物中含有预期的突变位点。 (2)再将突变引物和待突变质粒模板（前文制得的公司进行重组合成，实验室，以电脑已构建的pet28a-KRED菌体为模板，加入适量的DNA扩增酶，使用定点突变试剂盒进行PCR扩增，得到大量突变质粒。将其转化到感受态细胞中，涂布于含抗生素抗性（卡那霉素）的LB平板培养基上，将培养基放置于37℃恒温培养箱或37℃恒温摇床内培养。人工使用移液器挑取单菌落后，重复上步骤“(2)质粒提取”工艺，再将提取公司进行测序验证，验证后得到定点突变的重组菌株。将生长良好的不同突变体重组菌使用超声细胞破碎仪进行超声细胞破碎20min，再使用离心机以8000rpm的转速离心20min，取上清制得粗酶液。将上清粗酶液用于酶活性测定；通过菌体突变后测试酶活性，筛选出酶活性最佳的突变株。实验室废液S1、实验室固废S2。 (3)将获得的酶活性较好的突变重组菌BL21 pet28a- KRED(D320Y)用甘油划线培养，挑取单菌落至10mL的LB液体培养基放置于37℃恒温摇床内培养过夜，然后以0.05％的接种量接种于2L的LB液体培养基中，培养至用分光光度计测得OD600nm=0.6-0.8后，加入0.5mM的IPTG诱导剂，继续培养18h。诱导表达一定时间后，使用离心机以8000rpm转速在4℃下离心10min，弃上清，菌体用PBS缓冲液（主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾）200mL洗涤2次。再使用高压均质机或细胞破碎仪破碎菌体。菌体破碎液使用离心机以10000rpm转速在4℃下离心10min，收集上清，再使用冷冻干燥机将上清液冷冻干燥，制备成冻干酶粉。以上过程会产生冷凝废水W1、实验室废液S1、实验室固废S2。 5、生物催化反应重复进行“3、生物催化反应”步骤，通过生物催化工艺判断酶的催化性能。该过程会产生反应废气G2、试剂挥发废气G3、实验室废液S1、实验室固废S2。注：以上工序涉及微生物培养会产生生物气溶胶，根据《实验室生物安全管理条例》（国务院令2004-第424号），第四类病原微生物指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物，且《实验室生物安全通用准则》（WS233-2017）中针对**实验室未提出使用专用生物安全设备要求和生物气溶胶废气处理要求，生物气溶胶对人体、环境基本无害，直接室内排放不会产生影响，故不作为污染物进行识别。	本项目主要从事化学药和生物药的小试研发实验，主要包括生物酶在医药中间体合成中的应用及研发实验，以及生物酶在抗体药合成中的应用及研发实验，研发实验内容均类似，研发实验总体工艺流程如下图所示：图2-2 生物酶在医药中间体/抗体药合成中的应用工艺流程图具体工艺流程及说明如下： 1、酶挖掘图2-3 酶挖掘工艺流程图工艺流程说明：从文献或者AI预测找出相关酶的基因序列并进行筛选，以此作为基因探针在公共基因组数据库中检索，筛选得到与探针序列具有一定同源性的基因序列，**公司进行合成，将委外合成的表达载体为pET 28a的基因序列取回。 2、酶表达和发酵 (1)质粒构建：图2-4 质粒构建工艺流程图工艺流程说明：实验室内使用电转仪等设备将表达载体为pET 28a的基因序列转入宿主细胞，即大肠杆菌BL21(DE3)/大肠杆菌DH5α/大肠杆菌TOP10内，重组质粒进入宿主细胞后，融合到宿主细胞的染色体中，随后遵循细胞的转录和翻译机制，将细胞加入LB培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等），置于37℃恒温摇床内培养30~60min，使用离心机以3000rpm的转速离心2min，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂平板，再把平板放入37℃培养箱培养过夜。以上过程产生的离实验室废液S1，产生的废培养基及一次实验室固废S2。 (2)质粒提取：图2-5 质粒提取工艺流程图工艺流程说明：使用AxyGen公司的Plasmid Miniprep Kit试剂盒用离心法提取，具体如下： a.质粒提取将前文培养超过8h的菌液置于2mL试剂盒配套的EP管中，使用离心机以12000rpm的转速离心1min，弃尽上清。用250μL已加入试剂盒配套的RNase A（核糖核酸酶A）的Buffer S1细菌悬浮液（S1核酸酶）悬浮EP管底部的菌体，人工使用移液器的枪头吹打使菌体悬浮均匀。加250μL试剂盒配套的Buffer S2细菌裂解液，温和并充分的手动上下翻转4-6次混合均匀，直至形成透亮的溶液。加入350μL试剂盒配套的Buffer S3中和液，温和并且充分的手动上下翻转6-8次混合均匀，使用离心机以12000rpm的转速离心10min。将EP管中离心后的上清液倒入试剂盒内配有的DNA制备管（置于2mL离心管中）中，使用离心机以12000rpm的转速离心1min，弃掉滤液。将DNA制备管置回2mL离心管内，加500μL试剂盒配套的Buffer W1洗涤液，使用离心机以12000rpm的转速离心1min，弃掉滤液。将DNA制备管置回2mL离心管内，加700μL试剂盒配套的 Buffer W2去盐液，使用离心机以12000rpm的转速离心1min，弃掉滤液；以同样的方法再加700μL试剂盒配套的Buffer W2去盐液再洗涤一次。洗涤后弃掉滤液。将制备管置回2mL离心管中，使用离心机以12000rpm的转速离心1min。将制备管置回1.5mL离心管中，在DNA制备管膜中央加 20-40μL超纯水（超纯水预先水浴加热至65℃), 在室温下静置1min，使用离心机以12000rpm的转速离心1min。丢掉DNA制备管，离心管底部的液体即为质粒。 b.琼脂糖凝胶电泳提前使用超纯水将制胶工具清洗干净，准备好制胶平板，用琼脂将模具边缘封闭，架好梳子；根据要分离的样品（DNA）大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶。使用纯化水将琼脂糖加热融化，再将融化后的琼脂溶液摇晃混匀，倒入电泳槽中，在室温下等其凝固30-40min后，小心的拔出梳子，取出凝固好的凝胶放入电泳槽内，准备上样。在电泳槽中倒入电泳TAE缓冲液，倒入没过胶面1mm左右，去除胶孔内的气泡。上样，取1-2μL的 DNA样品加入电泳上样缓冲液，用枪混匀后加入到凝胶孔内。上样结束后，接通电源，红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极向正极运动，加样孔侧为负，在120V电压下跑12min。结束后关闭电源，在凝胶成像系统上观察观察是否有符合质粒大小的明亮条带。 c.将装有质粒(pET 28a-KRED)的离心管标记好，置于-20℃冰箱内保存冷藏，作为PCR模板或者质粒转化时使用。以上过程离心上清液、实验室废液S1，离心管、枪头等一次性耗实验室固废S2。 (3)质粒转化：图2-6 质粒转化工艺流程图工艺流程说明：将提取好的质粒加入100uL感受态细胞（大肠杆菌BL21(DE3)/大肠杆菌DH5α/大肠杆菌TOP10）中，在低温循环水浴器内冰浴30min，再于42℃水浴中热激90s，之后迅速放置冰上冷却5min，再加入1mL的LB培养基（主要成分为蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等），置于37℃恒温摇床内复苏1h，将复苏的培养物使用离心机以3000rpm的转速离心100min，取出其中1mL的上清液，将其余的培养液涂布于含抗生素抗性（卡那霉素）的LB平板培养基上，将培养基放置于37℃恒温培养箱或37℃恒温摇床内培养过夜。人工使用移液器挑取单菌落后，重复上步骤“(2)质粒提取”工艺，再将提取公司进行测序验证，验证pET 28a质粒是否转移到细胞内，验证后得到BL21/pet28a-KRED菌体。以上过程会实验室废液S1，离心管、枪头等一次性耗材及实验室固废S2。 (4)酶表达：图2-7 酶表达工艺流程图工艺流程说明：将BL21/pet28a-KRED菌体加入含有抗生素（卡那霉素）的LB培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等，下同）中，放置于37℃恒温摇床内振荡培养至用分光光度计测得OD值=0.6-0.8后，加入0.2mM的IPTG诱导液，于30℃恒温摇床内振荡培养过夜。使用离心机以8000rpm的转速将培养液离心5min后收集细胞，用0.05M、pH7.0的磷酸盐缓冲液（企业自制，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等，下同）重悬细胞，再使用高压均质机或细胞破碎仪破碎细胞。使用离心机以12000rpm转速4℃离心20min后收集上清，再使用冷冻干燥机将上清液在低温下快速冻结，然后在适当的真空环境下，使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出，使物品干燥，制备成冻干酶粉；冷冻干燥机将升华出的水蒸气通过冷凝器冷凝成凝结水排出，识别为冷凝废水W1。以上过程产生的离实验室废液S1，离心管、枪头等一次性耗实验室固废S2。 (5)酶发酵：图2- 8 酶发酵工艺流程图工艺流程说明： a.将构建的基因工程菌BL21/pet28a-KRED接入LB斜面培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母粉、氯化钠、甘油或葡萄糖、琼脂糖）中，在37℃恒温培养箱内培养18h； b.接1环斜面基因工程菌BL21/pet28a-KRED菌种于LB液体种子培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母粉、氯化钠、甘油或葡萄糖）中，在37℃恒温培养箱内培养8h； c.在2L发酵罐中装入重新配置的液体种子培养基（企业自制，主要成分为蛋白胨、酵母粉、氯化钠、甘油或葡萄糖），再将前文制得的LB液体种子培养基以7％体积比种量接入液体种子培养基内，放入2L发酵罐中，保持初始转速200r/min、初始通空气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在25％以上，期间使用20％氨水调节pH值稳定在7.0，在37℃条件下培养9h，再降温至26℃表达。发酵过程定期打开排气阀，利用气体管路进行排气，该过程会产生发酵废气G1（主要成分为氨、臭气浓度）。发酵过程中采用pH-stat方式流加补料培养基（补加LB培养基浓缩液，成分种类不变，仅增加蛋白胨含量）。发酵结束后，使用冷冻离心机以8000r/min的转速在4℃下离心10min收集菌体，再使用无菌生理盐水（企业自制，主要成分为氯化钠）洗涤基因工程菌2次。将发酵液使用冷冻离心机以8000rpm转速离心5min收集细胞，使用0.05M 、pH7.0的磷酸盐缓冲液（企业自制，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等）重悬细胞，再使用高压均质机或细胞破碎仪破碎细胞。使用冷冻离心机以12000rpm转速在4℃下离心20min后收集上清，再使用冷冻干燥机将上清液进行冷冻干燥，制备成冻干酶粉。实验室废液S1、实验室固废S2、冷凝废水W1。 3、生物催化反应图 2-9 生物催化反应工艺流程图工艺流程说明： (1)生物催化反应：本项目化学药研发实验选取具有代表性的“医药中间体4-氯乙酰乙酸乙酯”作为示例，在2L反应釜内投加180g/L原料溶液，即医药中间体（如：4-氯乙酰乙酸乙酯），加入NADH辅酶、异丙醇，使用氢氧化钠调节pH为7.0，然后再加入步骤(5)“酶发酵”制备的冻干酶粉进行合成转化反应，转化过程中使用全自动电位滴定仪自动加柠檬酸/33%盐酸/98%硫酸/85%磷酸控制pH在7.0，使用低温循环水浴控制温度在40℃,同时使用配套搅拌器磁力搅拌控制转速500rpm，随时观察产物转化情况，直到检测不出原料后结束反应。通过比较反应结束时间、反应釜内产生生成情况判断酶的催化活性，从而得出酶催化性能的结论。该过程反应方程式如下所示：本项目生物药研发实验选取具有代表性的“抗体”作为示例，抗体在 SrtA（半胱氨酸转肽酶）和抗payload抗体存在下，使用低温循环水浴控制温度在30℃,使用搅拌器磁力搅拌控制转速450rpm下搅拌10h，合成被抗payload抗体修饰的抗体，主要原理为酶分子与抗体或抗体分子共价结合，该过程反应方程式如下所示：此过程在通风橱内进行操作，反应过程中实验容器保持封闭状态，仅在反应容器开关盖过程反应物中挥发废气逸散，会产生反应废气G2；反应后反应容器中剩余化实验室废液S1处置。 (2)提纯、分析测试：反应结束后，在部分反应物中人工加入二氯甲烷、三氯甲烷作为萃取剂进行萃取，目的是利用液态的萃取剂处理与之不互溶的双组分或多组分溶液，实现组分分离；萃取后将提纯后的溶液转移到旋蒸仪中进行旋蒸，抽走二氯甲烷、三氯甲烷，得到提纯后的产物；该过程二氯甲烷、三氯甲烷试剂挥发会产生有机废气，并入试剂挥发废气G3中一并识别。提纯后使用高通量气相色谱仪、高通量超高压液相色谱仪、高通量超临界二氧化碳色谱仪(UPCC)等设备对提纯后的样品进行分析测试，得出结论。该过程会使用乙腈、甲醇等有机溶剂，会产生试剂挥发废气G3、实验室废液S1、实验室固废S2。经分析实验室废液S1，作为危废处置。 4、酶定向进化图2-10 酶定向进化工艺流程图工艺流程说明：根据前文分析测试结果对酶进行优化。此工序利用定点突变试剂盒完成，利用PCR扩增技术进行体外基因定点突变。主要工序如下： (1)首先，需要先使用电脑设计用于突变的引物D320F、D320R，在引物中含有预期的突变位点。 (2)再将突变引物和待突变质粒模板（前文制得的公司进行重组合成，实验室，以电脑已构建的pet28a-KRED菌体为模板，加入适量的DNA扩增酶，使用定点突变试剂盒进行PCR扩增，得到大量突变质粒。将其转化到感受态细胞中，涂布于含抗生素抗性（卡那霉素）的LB平板培养基上，将培养基放置于37℃恒温培养箱或37℃恒温摇床内培养。人工使用移液器挑取单菌落后，重复上步骤“(2)质粒提取”工艺，再将提取公司进行测序验证，验证后得到定点突变的重组菌株。将生长良好的不同突变体重组菌使用超声细胞破碎仪进行超声细胞破碎20min，再使用离心机以8000rpm的转速离心20min，取上清制得粗酶液。将上清粗酶液用于酶活性测定；通过菌体突变后测试酶活性，筛选出酶活性最佳的突变株。实验室废液S1、实验室固废S2。 (3)将获得的酶活性较好的突变重组菌BL21 pet28a- KRED(D320Y)用甘油划线培养，挑取单菌落至10mL的LB液体培养基放置于37℃恒温摇床内培养过夜，然后以0.05％的接种量接种于2L的LB液体培养基中，培养至用分光光度计测得OD600nm=0.6-0.8后，加入0.5mM的IPTG诱导剂，继续培养18h。诱导表达一定时间后，使用离心机以8000rpm转速在4℃下离心10min，弃上清，菌体用PBS缓冲液（主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾）200mL洗涤2次。再使用高压均质机或细胞破碎仪破碎菌体。菌体破碎液使用离心机以10000rpm转速在4℃下离心10min，收集上清，再使用冷冻干燥机将上清液冷冻干燥，制备成冻干酶粉。以上过程会产生冷凝废水W1、实验室废液S1、实验室固废S2。 5、生物催化反应重复进行“3、生物催化反应”步骤，通过生物催化工艺判断酶的催化性能。该过程会产生反应废气G2、试剂挥发废气G3、实验室废液S1、实验室固废S2。注：以上工序涉及微生物培养会产生生物气溶胶，根据《实验室生物安全管理条例》（国务院令2004-第424号），第四类病原微生物指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物，且《实验室生物安全通用准则》（WS233-2017）中针对**实验室未提出使用专用生物安全设备要求和生物气溶胶废气处理要求，生物气溶胶对人体、环境基本无害，直接室内排放不会产生影响，故不作为污染物进行识别。
无变动

环保设施或环保措施

环评文件及批复要求：实际建设情况：变动情况及原因：是否属于重大变动：是否重新报批环境影响报告书(表)文件：

各实验区域均设为密闭，试剂挥发废气、发酵废气、反应废气经通风橱和万向罩收集后汇入总管，危废暂存废气经房间整体排风后汇入总管，一并经活性炭吸附处理后通过DA001排气筒排放（高度16m）。本项目产生的冷凝废水、后道清洗废水、地面清洁废水、纯水制备尾水、水浴废水、灭菌废水、冷却废水、融冰废水、洗手废水和洗衣废水进入厂房外北侧地上消毒池消毒处理（投加氯片消毒，消毒接触池接触时间≥1h）后经DW001实验废水排放口排入厂区污水管网，生活污水经建筑污水管道排入厂区污水管网，最终纳入市政污水管网，**处理厂集中处理。本项目运行产生的危险废物，均委托资质单位处置，不会直接排入环境。产生的一般固废委托合法合规单位处理处置，生活垃圾由环卫部门统一清运。**实验室的贮存能符合相关规范的要求，能较好防止危险废物在暂存过程中产生的二次污染。本项目产生的固体废物能按照国家相关法规和标准规范要求处置，产生的固体废物实现零排放。1、选购低噪声设备； 2、合理布局，高噪声设备设隔振基础或减振垫； 3、风机设减振基础，并设置隔声罩，风机与管道连接部分做软连接，管道采取包扎措施； 4、设备运行过程中避免设备空开、空转现象，重视日常维护、保养工作。	各实验区域均设为密闭，试剂挥发废气、发酵废气、反应废气经通风橱和万向罩收集后汇入总管，危废暂存废气经房间整体排风后汇入总管，一并经活性炭吸附处理后通过DA001排气筒排放（高度16m）。本项目产生的冷凝废水、后道清洗废水、地面清洁废水、纯水制备尾水、水浴废水、灭菌废水、冷却废水、融冰废水、洗手废水和洗衣废水进入厂房外北侧地上消毒池消毒处理（投加氯片消毒，消毒接触池接触时间≥1h）后经DW001实验废水排放口排入厂区污水管网，生活污水经建筑污水管道排入厂区污水管网，最终纳入市政污水管网，**处理厂集中处理。本项目运行产生的危险废物，均委托资质单位处置，不会直接排入环境。产生的一般固废委托合法合规单位处理处置，生活垃圾由环卫部门统一清运。**实验室的贮存能符合相关规范的要求，能较好防止危险废物在暂存过程中产生的二次污染。本项目产生的固体废物能按照国家相关法规和标准规范要求处置，产生的固体废物实现零排放。1、选购低噪声设备； 2、合理布局，高噪声设备设隔振基础或减振垫； 3、风机设减振基础，并设置隔声罩，风机与管道连接部分做软连接，管道采取包扎措施； 4、设备运行过程中避免设备空开、空转现象，重视日常维护、保养工作。
无变动

其他

环评文件及批复要求：实际建设情况：变动情况及原因：是否属于重大变动：是否重新报批环境影响报告书(表)文件：

项目建设应严格执行配套建设的环保设施与主体工程同时设计、同时施工、同时投产使用的环保“三同时”制度。你单位应当按照环境信息公开有关规定，主动公开建设项目环境信息，接受社会监督。项目建成后，你单位应当按照竣工环境保护验收的有关规定，对配套建设的环境保护设施进行验收。	项目建设应严格执行配套建设的环保设施与主体工程同时设计、同时施工、同时投产使用的环保“三同时”制度。你单位应当按照环境信息公开有关规定，主动公开建设项目环境信息，接受社会监督。项目建成后，你单位应当按照竣工环境保护验收的有关规定，对配套建设的环境保护设施进行验收。
无变动

3、污染物排放量

污染物现有工程（已建成的）本工程（本期建设的）总体工程总体工程（现有工程+本工程）排放方式实际排放量实际排放量许可排放量 “以新带老”削减量区域平衡替代本工程削减量实际排放总量排放增减量废水水量（万吨/年） COD（吨/年）氨氮（吨/年）总磷（吨/年）总氮（吨/年）废气气量（万立方米/年）二氧化硫（吨/年）氮氧化物（吨/年）颗粒物（吨/年）挥发性有机物（吨/年）

0.0486	0.049	0.049
0.1989	0.199	0.199
0.0151	0.015	0.015
0.0024	0.002	0.002
0.0201	0.02	0.02
0	0	0	/
0	0	0	/
0	0	0	/
0	0	0	/
0	0	0	/

4、环境保护设施落实情况

表1 水污染治理设施

序号设施名称执行标准实际建设情况监测情况达标情况

消毒池

《****药行业污染物排放标准》（DB31/373-2010）表2生物医药研发机构间接排放限值

消毒池

监测达标

表2 大气污染治理设施

序号设施名称执行标准实际建设情况监测情况达标情况

活性炭吸附装置

《制药工业大气污染物排放标准》（DB31/310005-2021）表1、表2、附录C、《大气污染物综合排放标准》（DB31/933-2015）表1、附录A、《恶臭（异味）污染物排放标准》（DB31/1025-2016）表1、表2

活性炭吸附装置

监测达标

表3 噪声治理设施

序号设施名称执行标准实际建设情况监测情况达标情况

购低噪声设备；合理布局，高噪声设备设隔振基础或减振垫；风机设减振基础，并设置隔声罩，风机与管道连接部分做软连接，管道采取包扎措施；设备运行过程中避免设备空开、空转现象，重视日常维护、保养工作

《工业企业厂界环境噪声排放标准》（GB12348-2008）中3类功能区标准

监测达标

表4 地下水污染治理设施

序号环评文件及批复要求验收阶段落实情况是否落实环评文件及批复要求

表5 固废治理设施

序号环评文件及批复要求验收阶段落实情况是否落实环评文件及批复要求

危废暂存间位于厂房1层东南侧，面积约10㎡。一般工业固废暂存间位于厂房 1层东南侧，面积约4㎡。

表6 生态保护设施

序号环评文件及批复要求验收阶段落实情况是否落实环评文件及批复要求

表7 风险设施

序号环评文件及批复要求验收阶段落实情况是否落实环评文件及批复要求

5、环境保护对策措施落实情况

依托工程