肿瘤多组学测试分析服务

1.基本信息及主要参数

（1）标本类型与数量要求：

47个肿瘤样本的DirectRNA测序、蛋白测序、非靶代谢、RNA-seq测序、外显子测序。

（2）DirectRNA测序项目

本项包含基因组RNA的抽提、质检、建库和测序。

1）针对提供的样本进行RNA提取，通过凝胶电泳检测提供检测报告。构建DirectRNA文库，使用NanoporePromethION进行测序。

2）测序平台：要求使用NanoporePromethION平台。

3）每个样本（按样本数计）至少提供6Gb测序数据（rawdata），若数据质量不合格，供应商需要免费补测或重测直至数据质量符合要求。

4）总样品数（按样品数计）的测序N50>=1K。

5）样品基本提取合格率>=94%

6）样品测序数据在除去Nanopore建库试剂盒中的标准品的数据后，与参考基因组的mappingrate>=94%。

7）供应商负责fastq和fast5原始数据返还（产出比预期多的数据无偿为采购人所有）。

8）数据量：每个样本（按样本数计）数据量≥6Grawreads；Q值>=18（中位值）；每个样本的passreads测序数据量≥6Gb。

9）供应商需具备自己的nanopore测序平台。

（3）蛋白测序项目

本项目包含蛋白的提取、质检、建库和测序。

1）用质谱上样缓冲液溶解等量的肽段进行DIA检测分析；数据采集软件为ThermoXcalibur4.7(Thermo,USA)；分析柱信息为uPACHighThroughptucolumn(75μm×5.5cm,Thermo,USA)；色谱仪器为VanquishNeo（Thermo,USA）；质谱仪器：Astal（Thermo,USA）；色谱分离时间为8min；流动相A为2%乙腈（含0.1%甲酸）；流动相B为80%乙腈（含0.1%甲酸）。流动相梯度为0~0.1min，4~8%B；0.1~1min，8%~12.5%B；1~1.1min，12.5%~12.6%B；1.1~3.1min，12.6%~22.5%B；3.1~4.6min，22.5%~45%B；4.6~5min，45%~99%B；5~6.5min，99%B。纳升级高效液相色谱分离后的样品用质谱仪进行DIA质谱分析。检测模式为正离子，离源电压设置为1.5kV，MS及MSMS均质谱仪进检测和分析，数据采集模式为DIA。对质谱下机的原始文件经SpectronautTMSoftware18进行分析。搜库物种为XXX数据库为WWW.****...。搜库过程中肽段鉴定的错误发现率（FDR）设置为FDR≤0.01。蛋白至少含有一个特异肽段。

2）测序平台：要求使用Astral-DIA平台。

3）每个样本(按样本数计)色谱分离时间为8min，若数据质量不合格，供应商需要免费补测或重测直至数据质量符合要求。

4）样品基本提取合格率>=94%。

（4）非靶代谢项目

本项目包含蛋白的提取、检测、数据处理。

1）代谢物定性定量分析，其中代谢物定性：利用高分辨质谱仪采集物质二级质谱图。

2）所有样本的CV值分布图。

3）分析内容包括：总体样本主成分分析；主成分单变量统计过程控制；聚类分析；重复相关性评估；分组主成分分析；正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）（生物学重复≤2个无此项分析）；代谢物含量差异动态分布；差异代谢物筛选（差异代谢物条形图、差异代谢物雷达图、差异代谢物VIP值图、差异代谢物火山图、差异代谢物聚类热图、差异代谢物Z值图）（生物学重复≤2个：差异代谢物VIP值图形没有，差异代谢物火山图只能用FC+p值进行绘制）；差异代谢物相关性分析(差异代谢物相关性热图、差异代谢物和弦图、差异代谢物相关性网络图）；差异代谢物KEGG功能注释及富集分析（差异代谢物功能注释、差异代谢物KEGG分类、KEGG信号通路差异代谢物聚类分析、差异代谢物KEGG富集分析、KEGG代谢通路整体变化分析）。

（5）RNA-seq测序项目

本项目包含RNA的提取、质检、建库和测序。

1）技术内容包括：构建普通mRNA文库，测序策略为PE150。

2）测序平台：要求使用MGI测序平台。

3）mRNA测序数据量6Grawdata，总数据量满足的前提下，每个样本数据量不低于目标数据量的95%。若数据质量不合格，供应商需要免费补测或重测直至数据质量符合要求。

4）分析内容包括：对原始数据进行去除接头污染序列及低质量reads的处理；测序评估；与参考基因组比对；新基因分析；基因表达定量；样品相关性分析；主成分分析；差异表达基因筛选；差异表达基因聚类分析；差异基因韦恩图；差异表达基因的功能注释及富集分析；差异表达基因KEGG注释；差异表达基因KEGG通路富集分析；转录因子分析。

5）数据量：每个样本（按样本数计）rawdata数据量≥6Grawreads；

6）供应商需具备自己的MGI测序平台。

（6）外显子测序项目

项目包括样品DNA提取、基因组建库、外显子组建库、高通量测序。

1）利用外显子组测序，全面覆盖基因组，提供测序数据能够用于基因变异分析提供检测项目；测序设备：illumina二代测序仪，测序策略PE150；样本提取：DNA≥500ng，无明显降解；插入片段：外显子组200~250bp，基因组重测序350~400bp；探针设计：v6芯片的基因组捕获范围约60M，V8芯片的基因组捕获范围约40M）

2）测序数据量：外显子组10Grawdata/样（测序深度100×），Fastq数据质量要求：Q20>90%，Q30>90%

3）外显子组/基因组重测序的基因组比对率：>98%

4）数据重复率：WES＜30%，WGS＜10%

5）外显子组区域覆盖度：>98.5%

6）提供检测项目报告质控指标(如DNA质量评估、测序质量评估)等并保证测序数据量、Fastq数据质量、基因组比对率、数据重复率、测序深度达标。

2.后续服务要求

（1）交付周期：收到样品后1个月内交付。

（2）数据储存能力：具备大数据量储存和传输能力。

（3）数据保存时限：在项目完结交付原始数据后，可保存原始数据半年。